免疫組化操作步驟

IHC 試驗操作步驟

實驗所需試劑：

3% H2O2 For 10.0 ml

1.0ml   H2O2 (30%)

9.0ml 單蒸水

     TBS(1×)   pH 7.6-8.0   For 1.0 L

                           3.0g Tris-base

                           8.0g NaCl

　　先加單蒸水至800ml，用HCL 調PH 至7.6-8.0加單蒸水至1.0L

    TBST(1×) 0.1% Tween-20pH 7.6-8.0

檸檬酸-檸檬酸鈉修復液（1×）pH6.0 For 1.0 L 0.4g 檸檬酸· H2O

3.0g 檸檬酸鈉 · 2H2O

加單蒸水至1.0 L

實驗步驟：

一. 脫蠟：

    在二甲苯（Ⅰ）中 20min，在二甲苯（Ⅱ）中 20min; 在無水乙醇（Ⅰ）中浸泡5min; 在無水乙醇（Ⅱ）中浸泡 5min; 95%乙醇中浸泡5min; 80%乙醇中浸泡5min; 60%乙醇中浸泡 5min; 單蒸水中 5min 泡洗三次。

二. 抗原修復：

　　取一定量的Tris-EDTA修復液于一帶蓋耐高溫容器里，再將容器于電陶爐上煮沸，后再放入待修復切片持續沸騰15min。完畢，放在室溫自然冷卻，40min后，降至室溫。

備注：根據不同實驗條件可選擇檸檬酸修復液等不同修復液。對于某些切片必須進行修復，某些切片如果容易脫片可以省略。

三. 免疫組織化學染色：

（1）取出切片架放入3%H2O2 溶液，于孵育盒中滅活10min，室溫;

（2）1xTBS 沖洗4-5 次，甩干，擦凈，滴加3％BSA50ul-100ul，室溫濕盒封閉1hour；

（3）用吸水紙吸去多余液體（注意不要干片），滴加稀釋好的一抗50 ul-

100ul，室溫濕盒孵育 1.5hour 或 4℃過夜;（4）1xTBST 沖洗4-5 次，滴加二抗50-100ul，室溫濕盒孵育30min;

（5）1xTBS 沖洗4-5 次;滴加DAB 顯色液，1－5min 后迅速沖洗干凈;

（6）滴加1 滴Mayor's 蘇木精（hematoxylin），復染1-2min,TBS 溶液或自來水中水洗藍化5-10min；

（7）梯度酒精及二甲苯脫水：分別在60%,80%,95%,100%Ⅰ、Ⅱ酒精中浸泡 5

分鐘，然后在二甲苯（III）中浸泡5 分鐘，二甲苯（IV）中浸泡5 分鐘。中性樹

膠封片，鏡檢。