新到細胞如何處理

新到細胞如何處理

      一、先梳理細胞的基本信息如下：

                                                         細胞正常圖片

       二、貼壁細胞處理操作步驟

       1、檢查細胞外包裝是否有無漏液，在顯微鏡100倍和200倍觀察拍照保存圖片。

       2、做好消毒工作后，將細胞轉移到培養箱中平衡2-6 h。

       3、轉移消毒超凈臺，將培養瓶立起收集培養基。

       4、胰酶消化（含 EDTA 0.25％）細胞，待細胞變圓后終止消化，轉移至 15 mL 離心管中1000 rpm，5min 離心棄掉上清。

       5、使用收集的完全培養基培養重懸細胞，進行更換帶透氣孔培養瓶，細胞生長穩定后換實驗室準備好的培養基。

      三、細胞傳代操作步驟

       1、提前超凈臺滅菌照射 30 min 左右。

       2、顯微鏡觀察細胞密度約 80%即可傳代。

       3、棄去培養基，加入 PBS清洗 2-3 遍即可。

       4、加適量胰酶消化（含 EDTA 0.25％），待細胞變圓后終止消化。

       5、轉移至 15 mL 離心管中1000 rpm，5 min 離心棄掉上清。

       6、加入完全培養基重懸，置于細胞培養箱中培養。

       四、細胞復蘇操作步驟

       1、準備工作：將完全培養液置37℃水浴鍋預熱30 min。

       2、將細胞從干冰里取出，檢查冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂。用鑷子夾住蓋子放入 37℃水浴中快速晃動（注意：水不能沒過蓋子，防止細菌污染），使其在 1 min左右完全融化。

       3、將細胞懸液轉至提前準備好的完全培養液中，離心1000 rpm 室溫 5 min 。

       4、棄上清，吸取1 mL完全培養液重懸細胞至單細胞懸液，轉移至裝有4 mL完全培養液的T25 cm2培養瓶 中，標記細胞名稱、復蘇日期、 代次，放置 37℃、5% CO2培養箱中培養。

       5、第二天觀察細胞狀態及貼壁情況。

       五、細胞凍存操作步驟

       1、超凈臺滅菌照射 30 min 左右。

       2、顯微鏡觀察細胞密度約 80%可傳代。

       3、棄去培養基，加入 PBS清洗 2-3 遍即可。

       4、加適量胰酶消化（含 EDTA 0.25％），待細胞變圓后終止消化。

       5、轉移至 15 mL 離心管中1000 rpm，5 min 離心棄掉上清。

       6、細胞凍存液配置：胎牛血清與 DMSO =9:1 的比例配置凍存液1 mL 即可。加入 1 mL凍存液重懸轉移入凍存管，標記細胞名稱、細胞代數和日期。

       7、將凍存管放入程序降溫盒，-80℃冰箱過夜，次日移入液氮罐中長期保存。

       六、注意事項

       1、復蘇操作時間不可太長，盡量在15min內完成。請勿直接復蘇到T75cm2瓶或10cm皿，面積太大影響的生長速度，建議復蘇在T25瓶。

       2、若復蘇后24h細胞狀態不好或分化較多，建議再次復蘇時根據細胞量復蘇到六孔板里。

       3、多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開,往往會使一種細胞被另種細胞污染。

       4、血清質量差異可能會對細胞生長有影響，建議使用高級血清進行培養，如果沒有高級血清，可提高血清濃度進行培養。

       5、每一種細胞系都應有充足的凍存儲備，防止細胞污染等因素造成細胞系絕種，而且每一批次培養的細胞狀態都不同，應該選狀態較好批次凍存保種。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或者發生改變。