EdU法細胞增殖功能檢測

EdU法細胞增殖功能檢測

       一、簡介

       EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見，能夠在DNA復制時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在合成的DNA分子中，基于Apollo?熒光染料與EdU的特異性反應即可直接并準確地檢測出DNA復制活性，廣泛應用于細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA損傷修復、病毒繁殖等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及各種藥物的細胞增殖及活力篩選實驗。

       二、操作步驟（碧云天，C0075S）

       1.細胞制備：在6孔板中培養適當數量的細胞。細胞培養過夜并且恢復到正常狀態后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。

       2.將配制2X的EdU工作液(20μM)進行37oC預熱，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變為1X。如設計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養基為1mL，則將1mL 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。

       3.繼續孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續孵育細胞周期10%左右的時間。

       4.EdU標記細胞完成后，去除培養液，對于流式細胞儀檢測，貼壁細胞胰酶消化后用培養液重懸后再加入1mL 4%多聚甲醛固定15min。

       5.去除固定液，每孔用1mL洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。

       6.去除洗滌液，每孔用1mL通透液（含0.3% Triton X-100的PBS），室溫孵育10-15分鐘。

       7.去除通透液，每孔用1mL洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。

       8.配制Click Additive Solution：用1.3mL去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。

       9.配制Click反應液，如下表。

       10.去除上一步驟中的洗滌液。

       11.每孔加入0.5 mL Click反應液，輕輕搖晃培養板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。

       12.室溫避光孵育30分鐘。

       13.吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。

       14.細胞懸液樣品進行流式檢測，Azide 555的最大激發波長是555 nm，最大發射波長是565 nm。

       三、結果展示

       四、實驗注意事項

       1.Click Additive配制成溶液后請注意適當分裝。如果溶解后有白色物質析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，

請棄用。

       2.只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使疊氮化物探針有效進入細胞并發生點擊反應，不會影響細胞形態，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也

不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測細胞核。

       3.注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應液，否則點擊反應可能無法有效進行；同時，Click反應液須在配制后15分鐘內使用。