聊聊細胞支原體污染

        一、簡介

       支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0. 2μm) 并獨立生活的微生物，約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性，可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構，電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。

      二、支原體的污染來源

       1、細胞之間交叉污染

       2、細胞培養操作人員的口腔、皮膚等

       3、工作環境或實驗器材的污染

       4、培養基的污染

       三、支原體污染的嚴重性

       1、細胞外形可以沒有明顯的變化，支原體可以與細胞共存，污染后細胞液不會死亡，培養基一般不發生渾濁。

       2、使用被支原體污染的細胞做實驗會嚴重影響實驗的結果，因為支原體會抑制細胞生長；導致染色體畸變；細胞膜抗原性改變；細胞復蘇后存活率降低等。

       3、影響細胞的代謝和功能：培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動使培液成分發生改變（如發酵型支原體降解糖類產生酸性物質），影響細胞代謝。

       4、培養過程細胞破碎多，培養基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養基。

       5、細胞被支原體污染后會形成共生體系導致污染不斷擴大。

       四、支原體檢查法（常用檢查法）

      1、指示細胞培養法

       DNA染色法：供試品接種于指示細胞（無污染的Vero細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞）

      2、支原體熒光定量PCR檢測試劑盒(qPCR一步法）

       FAM通道：檢測支原體熒光信號。HEX通道：檢測內控對照熒光信號。

       支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。

       支原體DNA越多，FAM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低。

       定量需基于Ct值和DNA標準曲線。

       Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。

       3、PCR法支原體檢測電泳

       +：陽性對照； - ：陰性對照；1：送檢樣品（感染支原體）；2：送檢樣品（未感染支原體）；3：樣品1的干擾實驗；4：樣品2的干擾實驗。

       若在270bp處有條帶，檢測結果為陽性。陽性對照及干擾實驗PCR產物在270bp處有一條帶，陰性對照無條帶，證明本次實驗準確可靠。

       4、試劑法（諾唯贊支原體檢測試劑，D101-01）

       加樣

       樣品：向反應管中加入1 μl待測培養液上清

       MycoBlue Buffer   24 μl

       MycoBlue Enzyme   1μl

       陽性對照：加入1 μl Positive Control

       陰性對照：不加入任何樣品或加入1 μl Nuclease-free ddH2O

       ▲如果反應是在水浴鍋中進行，則在每管中加入25 μl Paraffin Oil。

       ▲如果反應是在PCR儀中進行，不需要加入Paraffin Oil。

       反應將水浴鍋或PCR儀溫度設置成60℃，放入反應管，孵育60 min。

       結果：有陽性結果說明細胞有支原體污染，支原體污染嚴重細胞形態變性有拉絲的現象。