SDS在分子實驗的作用

SDS在分子實驗的作用

       一、簡介

       SDS（十二烷基硫酸鈉）是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子和分子間的氫鍵，使分子去折疊,破壞蛋白分子二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇,二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后,分子被解聚成多肽鏈,解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量,這樣就消除不同分子間的電荷差異和結構差異。

       二、SDS-PAGE實驗

       十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)是聚丙烯酰胺凝膠電泳中最常用的一種蛋白表達分析技術。

原理是根據檢測中蛋白質分子量大小不同,使其在電泳膠中分離。聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構,具有分子篩效應,蛋白質在電場的遷移率差異依賴于樣品中各種分子攜帶的電荷,分子大小與

形狀的差別。

在聚丙烯酰胺凝膠電泳加入陰離子去垢劑SDS,蛋白質在加熱變性以后與SDS結合，帶上負電荷,在電場的作用下，向正極移動，結果按分子量大小排列在膠板上，含量多的蛋白帶紋粗，

蛋白質的遷移率主要取決于分子量大小。

       Western-blot中的作用

       1、陰離子去污劑，作為變性劑，變性蛋白質，消除分子之間電荷差異。若SDS不能完全消除兩類蛋白質的電荷差異：①糖蛋白（寡糖側鏈阻止了SDS膠束與蛋白質的結合）②強

堿性蛋白（如組蛋白，SDS不足以中和所有正電荷）。

       解決辦法：糖蛋白可用Tris-硼酸堿性緩沖液增加蛋白負電荷；組蛋白可用梯度凝膠電泳。

       2、SDS通常是10%（w/v）濃度，堿性溶液儲存，工作濃度常為0.1%-0.5%。

       3、SDS在高鹽溶液或者離液序列高的溶液中溶解度較低。因此，胍鹽（如蛋白變性劑硫氰酸胍）不能和SDS混合，否則會導致SDS沉淀。

       離液序列高的鹽溶液（chaotropic salt）：是一種破壞分子力（氫鍵）穩定性的一種鹽，能夠干擾分子間的由非共價鍵（力）形成的相互作用，如氫鍵、范德華力、疏水作用，能

破壞大分子的三級結構，諸如蛋白、DNA、RNA，并使其變性。

      SDS在16℃以下時，會緩慢沉淀，為了防止其沉淀，可添加Triton X-100防止其低溫沉淀。此外，還可換用十二烷基硫酸鋰。

三、DNA提取&SDS法

       SDS (十二烷基硫酸鈉)是一種陰離子去垢劑,在高溫(55-65°C)條件下能裂解細胞，使染色體離析、蛋白變性，同時SDS與蛋白質和多糖結合成復合物，釋放出核酸。提高鹽濃度并降

低溫度(冰浴)，使蛋白質及多糖雜質沉淀更加完全，離心后去除沉淀，上清液中DNA用異戊醇/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中DNA。該方法操作簡單、溫和，也可提取到高分

子量的DNA,但得到的的產物含糖類雜質較多。主要應用于動物組織、血液、細胞、細菌和酵母等基因組DNA的提取。

       在DNA提取的作用

       1、破壞細胞膜，提高染色質獲得率

       2、抑制RNase和DNase（和蛋白酶K協同，此時SDS濃度多為0.5% w/v，因為蛋白酶K在此濃度下活性最大），防止DNA降解。

       3、DNA打斷（ChIP或ChIA-PET）提高DNA打斷效率

       SDS濃度越高，DNA打斷效率越高，但是SDS濃度過高可能使蛋白質變性較嚴重，可能會損傷抗原表位，影響抗體的識別和結合。因此超聲過程中，SDS濃度應為0.1%（w/v）以下。

       延伸：影響CHIP試驗超聲的因素

       1、 超聲儀的參數設置（包括時間、超聲頻率）

       2、 超聲用的buffer

       a.   SDS濃度（影響最大）：SDS 濃度越高，DNA 越容易被打斷

       b.   鹽離子：鹽離子濃度越高，DNA 越容易被打斷

       c.   其他表面活性劑濃度（如Triton X-100）：濃度越高，DNA 越容易被打斷

       3、細胞密度

       細胞密度越高，DNA 越不容易被打斷。建議的細胞密度應小于107個/ml裂解液。

       4、細胞類型

       DNA打斷難易程度：原代細胞、組織細胞系>腫瘤細胞系。