克隆形成實驗

克隆形成實驗

一、簡介

       當單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。其中細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量。軟

瓊脂克隆形成實驗主要用于非貼壁生長的細胞，某些細胞(如正常成纖維細胞)在懸浮狀態下不能增殖，不適用此法。某些惡性腫瘤細胞，不僅在貼壁狀態下能增殖，在懸浮狀態下也

能增殖,其在軟瓊脂中形成克隆的能力反映了其惡性程度。

二、克隆形成的分類

       1、平板克隆形成用于貼壁細胞

       2、軟瓊脂克隆形成用于懸浮腫瘤細胞

三、操作步驟

       1、平板克隆形成

       a.取對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化，離心收集細胞沉淀。

       b.完全培養基重懸，根據細胞增殖能力，將細胞懸液作梯度倍數稀釋。一般以每皿含100個、200 個細胞的細胞濃度，將細胞懸液接種培養皿中，輕輕晃動使細胞分散均勻。

       c.將培養皿置于5% CO2培養箱, 靜止培養2~3周。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。

       d.取出細胞棄掉培養基，用1x PBS 清洗 2-3次。

       e.4%多聚甲醛室溫固定15 min，用1x PBS 清洗 2-3次，棄去多聚甲醛。

       f.加入0.01%結晶紫室溫染8min，用1x PBS 清洗 3次。

       g.顯微鏡拍照或者顯微鏡掃描，克隆形成率=集落數/接種細胞數x 100%計算克隆形成率。

       2、軟瓊脂克隆形成

       a.取對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化，離心收集細胞沉淀。

       b.完全培養基重懸，將活細胞調整密度為1x103/ml。

       c.取0.5ml細胞懸液，加入培養基體積達到9.4 ml ，37℃孵育。

       d.配制底層瓊脂：5%瓊脂置沸水浴中，待完全融化，取出1 ml移入無菌小燒杯中，待冷卻到40°C時，迅速加入9ml預溫37°C的完全培養基，混勻立即取0.8ml澆注24孔板，室

溫凝固。

       e.上層瓊脂的制備：取0.6 ml 40°C的5%瓊脂加入到預溫9 .4 ml細胞懸液迅速混勻,立即取0.8 ml澆入24孔板，置室溫凝固。每孔即含有40個細胞，一般每個實驗組重復3次。

       f.放置CO2培養箱，培養2-3周時間。

       g.將培養板置于顯微鏡下計數克隆數，每個細胞集落含50個或大于50個細胞為1個克隆，以公式集落數= n孔中細胞集落數總和/ n,克隆形成率=集落數/接種細胞數x 100%計算

克隆形成率，后再拍照。

四、結果展示

五、實驗注意事項

       1、細胞懸液中單個分散細胞應多于90%，平板培養早期盡不要晃動培養皿，以晚細胞脫落，導致實驗誤差增加。

       2、平板培養期間應及時更換新鮮培養基，保持培養物獲得充分的營養成分。

       3、接種細胞密度不過高。

       4、在進行軟瓊脂克隆形成實驗時，首先細胞計數要準確，可以重復計數，取平均值。其次在實驗的操作過程中，很多步驟可能會引起污染，一定要注意。

       5、在將細胞懸液和瓊脂混合的時候，一定要把握好瓊脂溫度，太高時，容易引起部分細胞死亡，太低則容易使局部結塊。

       6、關于選擇接種多少細胞的問題，24孔板一個孔，30-50個細胞已足夠。太少，結果不準確；太多，計數太麻煩。還要根據細胞增殖能力或者說惡性程度來決定。當細胞增殖

能力非常強時，可選擇少接種一些細胞；當細胞增殖能力很弱時，可增加細胞接種數。