Hoechst 33258染色

Hoechst 33258染色

一、簡介

       Hoechst 33258，也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式為C25H24N6O · 3HCl，分子量為533.88，索萊寶，C0021

       Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。Hoechst 33258 為特異性 DNA 染料，與 A-T 鍵結合，這種染料對死細胞或經 70% 冷乙醇固定

的細胞可立即染色。而活細胞的著色是漸進性的，在 10min 內可達飽和。在熒光顯微鏡下，活細胞核呈彌散均勻熒光，出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊

狀熒光。

       Hoechst 33258的最大激發波長為346nm，最大發射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，最大激發波長為352nm，最大發射波長為461nm。

二、試劑與材料

       1. Hoechst 33258 即用型染液濃度為1mg/mL，使用前用生理鹽水或PBS將Hoechst 33258染液稀釋100倍，即為工作液。

       2. 封片液：抗熒光衰減封片劑

       3. 細胞固定液： 甲醇、冰乙醇（ 3∶1 ）現配； 70%冷乙醇；4%多聚甲醛。

三、操作步驟

       1、細胞制備:從細胞培養箱取出細胞爬片，光學顯微鏡下觀察細胞生長成單層，棄上清液，PBS洗1次。（若熒光顯微鏡是倒置就不需要細胞爬片）

       2、細胞固定：細胞給藥發生凋亡后，去除培養液，加入0.5ml固定液（注：4%多聚甲醛），固定10分鐘或更長時間（可4℃過夜）。

       3、洗滌：PBS浸洗3次，每次5 min。去除多余的PBS。

       4、染色：加入0.5 ml Hoechst 33258染色液(5mg/L)，染色5 min?？捎脫u床，或手動晃動數次。PBS浸洗3次，每次5 min。

       5、封片：滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液，切勿弄反。

       6、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發波長在350nm左右，發射波長在460 nm左右。

       注：室溫下晾干,在熒光(檢測波長360nm,參比波長450nm ) 顯微鏡下觀察, 并隨機拍照。

四、結果展示

五、實驗注意事項

       1、如果熒光顯微鏡是倒置的，就不用爬片，可以直接固定，染色，觀察。不是倒置的無法直接看，爬片后，倒蓋在玻片上，顯微鏡才可以看。

       2、該染料不建議活細胞染色，活細胞染色細胞很容易漂浮起來，不宜觀察和熒光拍照，染料濃度過大導致細胞死亡，正式實驗前要摸索濃度和孵育時間。

       3、防止熒光淬滅。

       4、普通潔凈蓋玻片置于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超凈臺內吹干或用細胞培養PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔

板內，加細胞混懸液培養過夜，使約為50%-80%滿。