CCK8實驗

CCK8實驗

一、簡介

       CCK-8細胞增殖檢測試劑盒基于WST-8 (化學名: 2-(2-甲氧基.4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，能快速靈敏地檢測細胞增殖和細胞毒性。WST-8屬于MTT的升級產品，工作原理為:在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲瓚產物(formazan)，其顏色的深淺與存活細胞數目的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，可以間接反映活細胞的數量。

二、操作步驟

1、細胞增殖實驗

a. 取出細胞棄掉培養基，用PBS 清洗 2-3次，用適量胰酶消化液消化，使細胞變圓，終止消化后，1000 rpm，離心5 min，收集細胞；

b. 用1mL無血清培養基重懸細胞，進行細胞計數，將HuH-7細胞懸液(100 μl/孔)接種于 96 孔板中，細胞密度為 5000個/孔；

c. 待細胞貼壁后分別為 0、24、48、72、96 h ；

d. 在每孔中加入 10μl CCK-8 試劑，放置于 37℃，5% CO2細胞培養箱中繼續培養2 h；

e. 將 96 孔板取出，放于酶標儀上在波長為 450 nm 處測定吸光度，記錄并保存所得數據。

2、數據分析

細胞活力%=[A(加藥）- A（空白）]/[A(0加藥）- A（空白）] x 100%

使用SPSS軟件分析，以P值小于0.05為結果具有顯著性，使用graphpad prism 5.0 軟件繪制統計圖。

三、結果展示

四、實驗注意事項

1、貼壁細胞每孔至少需要接種1,000個細胞 (100μl的培養基)，檢測白細胞時由于它的靈敏度較低，每孔至少需要接種2,500 個細胞 (100μl的培養基)，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量。如果要使用24孔板或是6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

2、一定要設空白孔對照，在不含細胞的培養基中加入CCK-8，測定450 nm吸光度即為空白對照。在做加藥實驗 (細胞毒性實驗) 時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

3、如果藥物具有還原性，就會和CCK-8試劑發生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (只加CCK-8) 的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

4、CCK-8在避光0-5℃的條件下可以存放2年。在常溫下可以保存3周左右，顏色應該為淺紅色， 如果顏色發生改變，則可能會增加空白吸光度。

5、CCK-8試劑顏色為淡紅色與含有酚紅的培養基接近，容易加漏或多加，可以將CCK-8試劑按照100μl的完全培養基加10μl CCK-8試劑的比例配置所需的體積，用8道移液器每孔100μl加到96孔板中進行孵育檢測。