細胞免疫熒光

細胞免疫熒光

一、簡介

       免疫熒光染色(Immunofiuorescence,IF)的主要原理利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括直接法和間接法。直接法是蛋白和標記熒光素一抗結合，間接法

是蛋白和一抗結合，然后再與帶有熒光基團的二抗識別，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。

二、試劑與材料

1、生長于蓋玻片的貼壁細胞

2、封閉液（5%BSA/PBS）、抗體稀釋液（1%BSA/PBS）

3、固定劑

(1）冰甲醇和冰丙酮-20℃放置1h以上

(2）3%-4%多聚甲醛/PBS和0.5%Triton X-100/PBS

(3）3%-4%多聚甲醛/PBS和冰丙酮-20℃放置1h以上

4、一抗、熒光素標記二抗

5、封片介質、濕盒、組化筆、熒光顯微鏡

三、操作步驟 (間接法)

1、細胞制備:從細胞培養箱取出細胞爬片，光學顯微鏡下觀察細胞生長成單層，棄上清液，PBS洗1次。

2、細胞固定：根據抗原和組織細胞特點選擇以下一種細胞固定方法。

a. 甲醇/丙酮固定法：冰甲醇-20℃固定10min,棄多余甲醇，冰丙酮-20℃透化細胞1min。

b. 多聚甲醛/Triton固定法:3%-4%多聚甲醛/PBS固定10 min，PBS沖洗，0.5%Triton X-100透化細胞2-10 min。

c.多聚甲醛/甲醇固定法:3%-4%多聚甲醛/PBS固定10 min，PBS沖洗，冰甲醇-20℃透化細胞5-10 min。

3、洗滌：PBS浸洗3次，每次5 min。去除多余的PBS。

4、封閉：5%BSA/PBS室溫封閉30 min。

5、一抗孵育：滴加適當的一抗濃度在濕盒中室溫孵育1h或者4℃過夜。PBS浸洗3次，每次5min。

6、二抗孵育：加適當稀釋的熒光素標記二抗，使其覆蓋細胞，置于黑色濕盒內室溫孵育30min 以上。PBS浸洗3次，每次5min。

7、封片：滴加抗熒光衰減封片劑封片

8、熒光顯微鏡觀察。

四、結果展示

五、實驗注意事項

1、固定劑種類很多，大致分為有機溶劑和醛類交聯固定劑2類。①有機溶劑如甲醇和丙酮細胞穿透性強，能夠溶解如細胞膜磷脂(細胞透化)等類脂成分和脫水，使蛋白質和糖類抗原

轉變為不溶性沉淀，適合蛋白質和糖類抗原的固定。冷丙酮組織細胞穿透性和脫水作用強，抗原保存性好，常用于冷凍切片和細胞固定。②醛類交聯固定劑穿透性強，交聯細胞內自

由氨基團，使組織蛋白質相互交聯，抗原保持原位，在保持組織細胞結構完整性方面優于有機溶劑。貼壁和懸浮細胞表面抗原檢測時可以采用4%多聚甲醛固定，胞內抗檢測時加通

透劑如Triton X- 100。

2、如需檢測2種抗原時，可進行雙重熒光染色。間接法時，應確保二抗靶向不同種屬抗原特異性抗Fc, 并偶聯至不同染料。

3、防止熒光淬滅。

六、問題和解決方法