告別黑白條帶，迎接五彩斑斕

告別黑白條帶，迎接五彩斑斕

        談起免疫印跡（Western Blot）檢測，做科學研究的大家都知道，做蛋白機制研究都離不開WB檢測，在過去我們的WB結果都是白底黑帶，但是近年經常閱讀SCI文獻，發現很多高分影響因子文獻的WB結果圖發生很大的變化：白底變成了黑底，條帶從黑色變成了：紅，橙，黃，綠，藍等各種顏色，條帶亮度，對比度都很明顯，不同蛋白還能呈現出不同顏色的條帶，提高文章質量，體現出文章高級感。

       一、熒光WB的優勢

       化學發光信號是動態的，二抗是酶標記，屬于酶促動力學反應，信號隨時間的變化而變化，信號不與目標蛋白濃度成線性比例關系。而熒光信號熒光是靜態信號，不會隨著時間的變化而變化，信號持久，可達到精準定量。

       二、實驗操作步驟

      常見Western Blot顯色的方法主要有：放射自顯影、底物化學發光ECL、底物DAB呈色，熒光WB實驗步驟與傳統WB差異不是很大，最主要區別在于二抗：傳統WB檢測二抗是酶標記（HRP），而熒光WB二抗是用熒光標記，現在省掉繁雜的顯影，暗室等步驟，取而代之是利用熒光成像儀直接成像。

      1、傳統WB: 樣品制備→SDS-PADE電泳→蛋白轉膜→ 一抗孵育→HRP酶標二抗→化學發光

      2、熒光WB: 樣品制備→SDS-PADE電泳→蛋白轉膜→一抗孵育→熒光二抗→熒光成像

         三、實驗結果

傳統WB與熒光WB比較

       四、實驗注意事項

        1、實驗中孵育熒光二抗時要注意避光，熒光二抗多次重復使用，避免熒光背景。

        2、由于少量的激發光會穿過濾光片，因此曝光時間更長會導致背景熒光較高，需要注意避光。

        3、熒光二抗和熒光WB更配，適合做熒光WB的二抗有：

        山羊抗小鼠IgG二抗， 近紅外DyLight 680熒光標記

        山羊抗小鼠IgG二抗， 遠紅外DyLight 800熒光標記

        山羊抗小鼠IgG二抗， 綠色DyLight 488熒光標記

        山羊抗小鼠IgG二抗， 橙紅色DyLight 594熒光標記